隨著CRISPR-Cas技術(shù)的問世，人類改造、編輯生物基因密碼的腳步大大加快。有了這把趁手的“基因魔剪”，人類可以對基因進行高效地定點編輯。

然而，主流的Cas9和Cas12a酶似乎更擅長單個堿基的定點編輯，在進行大規(guī)模刪除DNA的時候顯得“力不從心”。不過10月19日，美國研究人員在《自然·方法》發(fā)表論文稱，他們開發(fā)出一種緊湊型級聯(lián)CRISPR-Cas3系統(tǒng)，可快速準確地對大規(guī)模DNA片段進行刪除。

傳統(tǒng)“魔剪”只能“剪”小片段DNA

CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型眾多，目前研究最深入應(yīng)用最成熟的就是CRISPR-Cas9系統(tǒng)。CRISPR-Cas9的結(jié)構(gòu)簡單，能夠很容易地進入任何細胞，并精確地作用于DNA。只需要用目標遺傳密碼序列對它進行編程，這一工具便能夠掃描整個DNA鏈，找到對應(yīng)部分的基因，在適當?shù)奈恢脤⑦@段DNA“剪”開。

“CRISPR-Cas9系統(tǒng)非常適合在明確或者校正某一個基因功能突變的時候，對單個基因進行剪輯或者小片段進行修改。”南開大學生命科學學院副院長陳凌懿教授介紹，雖然Cas9可以在需要的地方進行剪切，但是只能剪一刀，因此想刪除整個基因位點特別大的DNA片段時，就存在一定局限性。

“就像拆遷房子，如果小區(qū)里只有一幢危樓，那么只需要對這幢危樓進行維修或者拆除重建;但是如果要平整土地，或者拆除修補危樓的時候，那就要拆除更多的房子，破壞整個小區(qū)環(huán)境了。”陳凌懿說，拆遷一幢樓不可能大刀闊斧，但是拆遷很多房子就需要更高效的工具了。

陳凌懿進一步解釋說：“最近發(fā)現(xiàn)，Cas9產(chǎn)生的‘基因敲除’，通常通過在編碼基因的開放閱讀框中引入小的插入或刪除突變而導致移碼突變，這種方法適用于編碼蛋白質(zhì)的mRNA(信使RNA)。移碼突變是指，3個核苷酸密碼編碼一個氨基酸，當刪除的核苷酸數(shù)不是3的整數(shù)倍時，就會導致編碼順序發(fā)生錯位而出現(xiàn)的突變。然而，對非編碼RNA，因為其并不編碼蛋白質(zhì)，所以不存在移碼突變。此時，就需要采取全基因去除的方法。而哺乳動物的基因，一個基因可能很大，包括外顯子和內(nèi)含子，當幾個外顯子相距比較遠的時候，如果想完整刪除，就需要刪除很大片段DNA。”

對于真核細胞來說，可大片段刪除DNA的工具將促進對大部分非編碼基因片段的詢問，提高對大部分未知功能的編輯效率，它因此將成為一個強大的基因篩選工具。

升級版能“吃掉”大片段DNA

作為“基因魔剪”的CRISPR系統(tǒng)是如何工作的呢?

陳凌懿介紹，CRISPR系統(tǒng)主要由相關(guān)核酸酶(Cas9)和向?qū)NA(gRNA)組成。gRNA能識別出外來侵略者的特定核酸序列，在堿基配對成功后，Cas9蛋白會使識別位點的DNA雙鏈斷裂。隨后生物體自身存在著DNA損傷修復的應(yīng)答機制，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，大多數(shù)時候這種連接會引入片段或刪除突變，從而實現(xiàn)了細胞中目標基因的敲除。如果在此基礎(chǔ)上為細胞引入一個修復的“模板”(供體DNA分子)，這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變，以此實現(xiàn)基因的替換或者突變。

此次“升級版”新系統(tǒng)，稱為 CRISPR-Cas3系統(tǒng)，是由進行性核酸酶Cas3和其他成分組成的最小版本。該Cas3系統(tǒng)可用來切斷DNA片段，刪除長段DNA。而且它的精度很高，是少有的高質(zhì)量大規(guī)模編輯工具。Cas3系統(tǒng)只需要4個蛋白和1個crRNA，CRISPR-Cas9系統(tǒng)卻需要6個蛋白和1個crRNA，而在基因編輯時，需要將此系統(tǒng)導入到目標細胞中，系統(tǒng)越小，越容易操作。Cas3作為最小的CRISPR系統(tǒng)的一部分，兼具準確性和可變性，已在銅綠假單胞菌中高效地完成了堿基對數(shù)量高達424kb的基因組刪除。

“與Cas9剪一刀就完成任務(wù)不同，Cas3系統(tǒng)不僅像一把剪刀，還像‘吃豆人’游戲里的‘大嘴巴’。”陳凌懿介紹，Cas3系統(tǒng)找到特定的DNA靶標后，可以先像Cas9一樣剪斷DNA雙鏈，但是和Cas9不同，Cas3將停留在DNA斷點處繼續(xù)吞食DNA，很快就能“吃掉”一大段，最終造成大片段DNA的刪除。

“之所以可以變身‘吃豆人’，與Cas3的DNA酶特性有關(guān)，其亞單位比Cas9多一些，有結(jié)構(gòu)可以結(jié)合到DNA上。”陳凌懿解釋說，就相當于只有抓住繩子末端，才可以沿著繩子往前走。雖然Cas3和Cas9識別DNA特異序列的方式是一樣的，但是識別之后，剪切的方式是不一樣的。Cas3系統(tǒng)既有手的功能，能錨定在DNA的位點上，同時又有“吃豆人”的功能，不斷把DNA“吃”下去。

未來在工業(yè)發(fā)酵領(lǐng)域應(yīng)用價值大

CRISPR系統(tǒng)目前主要應(yīng)用于腫瘤、遺傳等疾病的治療方面。此次CRISPR-Cas3系統(tǒng)的出現(xiàn)，其高效率和高精度是否能讓CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用更加廣闊?

“在CRISPR-Cas9系統(tǒng)中存在的脫靶效應(yīng)，在大片段刪除系統(tǒng)中同樣存在這樣的風險。而且大片段刪除還增加另一個風險，就是可否準確地控制刪除的長度。”陳凌懿對CRISPR-Cas3系統(tǒng)刪除基因的精準性提出了質(zhì)疑?？茖W家在實驗室可以篩選出準確刪除目標基因的細胞;但是在臨床應(yīng)用中，可能會面臨更多的問題和挑戰(zhàn)。另外，目前的工作只證明了CRISPR-Cas3系統(tǒng)在細菌中起作用，能否在高等生物特別是哺乳動物中應(yīng)用CRISPR-Cas3系統(tǒng)進行大片段DNA的刪除，還有待證明。

“此外，在臨床上，患者進行治療時，我們檢測到某一個基因突變了，要定點把突變基因修復，這需要進行精準編輯。”陳凌懿認為，如果大片段刪除基因，就是一種大規(guī)模的破壞性治療，不符合臨床小規(guī)模、小修復的治療原則，這種案例非常少見。而且以目前我們對編碼或是非編碼基因的了解，大片段刪除或引入還有很多未知數(shù)，因此很可能病沒治好，反而增添了新病。

“雖然說目前應(yīng)用于臨床還有一定難度，但CRISPR-Cas3還可以在工業(yè)、農(nóng)業(yè)中發(fā)揮作用。”陳凌懿表示，比如工業(yè)發(fā)酵，所使用的菌種基因組越大，整個發(fā)酵過程中真正合成目標產(chǎn)物就越低效。“因此在進行工業(yè)發(fā)酵的時候，我們選擇菌種希望越簡單越好，除了菌種存活所必需的基因外，最好就一個酶。”陳凌懿說，把系統(tǒng)簡化的時候相當于把菌種里不需要的基因去掉，在最小基因組的細菌當中，引入新的基因。這種做減法的過程就可以使用CRISPR-Cas3系統(tǒng)進行大片段刪除來完成。如果DNA刪多了，菌種可能就死掉了，只有刪得合適了，才能得到基因組被簡化的活菌種。

標簽： DNA片段